人同型半胱氨酸(Hcy)Elisa 試劑盒說明書

本試劑盒僅供研究使用

檢測范圍：0.8 nmol/ml –50 nmol/ml

zui低檢測限：0.2 nmol/ml

特異性：本試劑盒可同時檢測天然或重組的人Hcy，且與其他相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。

有效期：6個月

預(yù)期應(yīng)用：ELISA法定量測定人血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清或其它相關(guān)生物液體中Hcy含量。

說明

1. 試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）；2-8℃（頻繁使用時）。
2. 濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。
3. 中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準(zhǔn)。
4. 剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象，不會對實驗結(jié)果造成任何影響。

概述

同型半胱氨酸Hcy又稱高半胱氨酸，是一種含硫氨基酸，不屬于組成蛋白質(zhì)的20種氨基酸，體內(nèi)不能合成，只能來源于蛋氨酸的分解代謝。Hcy是甲硫氨酸代謝形成的中間產(chǎn)物。，在體內(nèi)由甲硫氨酸轉(zhuǎn)甲基后生成，有兩種途徑。再甲基化途徑：約有50%Hcy在蛋氨酸合成酶的作用下，以維生素B12為輔因子，以N5-甲基四氫葉酸為甲基供體，發(fā)生再甲基化，重新合成蛋氨酸。轉(zhuǎn)硫途徑：另外約50%的Hcy經(jīng)轉(zhuǎn)硫途徑不可逆生成半胱氨酸和α酮丁酸，此過程需維生素B6依賴的胱硫醚β合成酶和甲硫氨酸合成酶參與。Hcy合成和代謝途徑及其相關(guān)的酶系統(tǒng)、葉酸、維生素B12和維生素B6的缺乏、MTHFR、甲硫氨酸合成酶(MS)、CBS的缺陷都可引起高同型半胱氨酸血癥。

實驗原理

用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗Hcy抗體的微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化的抗Hcy抗體、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的Hcy呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。

試劑盒組成及試劑配制

1. 酶聯(lián)板(Assay plate )：                                 一塊（96孔）。
2. 標(biāo)準(zhǔn)品（Standard）：                                 2瓶(凍干品)。
3. 樣品稀釋液(Sample Diluent)：                           1×20ml/瓶。
4. 生物素標(biāo)記抗體稀釋液（Biotin-antibody Diluent）：         1×10ml/瓶。
5. 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液（HRP-avidin Diluent）：  1×10ml/瓶。
6. 生物素標(biāo)記抗體（Biotin-antibody）：              1×120ul/瓶（1：100）。
7. 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素（HRP-avidin）：        1×120ul/瓶（1：100）。
8. 底物溶液（TMB Substrate）：                            1×10ml/瓶。
9. 濃洗滌液（Wash Buffer）：  1×20ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
10. 終止液（Stop Solution）：                      1×10ml/瓶（2N H₂SO4）。

需要而未提供的試劑和器材

1. 標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀
2. 高速離心機(jī)
3. 電熱恒溫培養(yǎng)箱
4. 干凈的試管和Eppendof管
5. 系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時，用多通道移液器

6.    蒸餾水，容量瓶等

標(biāo)本的采集及保存

1. 血清：全血標(biāo)本請于室溫放置2小時或4℃置夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2. 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或將標(biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3. 細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：請1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

注：標(biāo)本溶血會影響zui后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項檢測。

標(biāo)本的稀釋原則：

首先通過文獻(xiàn)檢索的方式了解待測樣本的大致含量，確定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)。只有稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi)，檢測的結(jié)果才是準(zhǔn)確的。稀釋的過程中，應(yīng)做好詳細(xì)的記錄。zui后計算濃度時，稀釋了“N"倍，標(biāo)本的濃度應(yīng)再乘以“N"。

標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋原則：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為50 nmol/ml，做系列倍比稀釋后，分別稀釋50 nmol/ml，25 nmol/ml，12.5 nmol/ml，6.2 nmol/ml，3.2 nmol/ml，1.6 nmol/ml，0.8 nmol/ml.，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 nmol/ml，臨用前15分鐘內(nèi)配制。

如配制25 nmol/ml l標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml（不要少于0.5ml）50 nmol/ml的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。

生物素標(biāo)記抗體的稀釋原則：

臨用前以生物素標(biāo)記抗體稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100ul），實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10ul生物素標(biāo)記抗體加990ul生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制。

辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素的稀釋原則：

臨用前以辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100ul），實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10ul辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素加990ul辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制。

操作步驟

實驗開始前，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭?，試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如樣品濃度過高時，用樣品稀釋液進(jìn)行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。

1. 加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?/span>100ul，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100ul，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)120分鐘。

為保證實驗結(jié)果有效性，每次實驗請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1. 棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加生物素標(biāo)記抗體工作液 100ul（取1ul生物素標(biāo)記抗體加99ul生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制），37℃,60分鐘。
2. 溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，200ul/每孔，甩干。
3. 每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液（同生物素標(biāo)記抗體工作液） 100ul，37℃，60分鐘。
4. 溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，200ul/每孔，甩干。
5. 依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）。
6. 依序每孔加終止溶液50ul，終止反應(yīng)（此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。
7. 用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行檢測。

實驗備注

1. 用戶在初次使用試劑盒時，應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到管底。
2. 每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2N H₂SO4。測量時先用此孔調(diào)OD值至零。
3. 為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜。
4. 未使用完的酶標(biāo)板或者試劑，請于2-8℃保存。標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記抗體工作液、辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液請依據(jù)所需的量配置使用。請勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記抗體工作液或、辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液。
5. 建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘。根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次。
自動洗板：如果有自動洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

計算

以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)），OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)），在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。

注意事項

1. 當(dāng)混合蛋白溶液時應(yīng)盡量輕緩，避免起泡。
2. 洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。
3. 一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。
4. 請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔。
5. 如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù)。
6. 在配制標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液工作液時，請以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。
7. 底物請避光保存。
8. 不要用其它生產(chǎn)廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。