293T細(xì)胞培養(yǎng)操作流程

1 目的 293T細(xì)胞是常用于包裝和擴(kuò)增病毒載體的工具細(xì)胞，因此做好293T細(xì)胞的培養(yǎng)，為保證相關(guān)實(shí)驗(yàn)的正常進(jìn)行提供必要條件。

2 適用范圍 本部門293T細(xì)胞培養(yǎng)

3 操作方法

3.1 將移液器和移液槍、15ml離心管、離心管架、75cm²新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶放于生物安全柜中，按照生物安全柜的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，將生物安全柜的紫外開啟半小時(shí)。

3.2 將含10%胎牛血清和100U/ml雙抗的DMEM及PBS放于37℃水浴鍋中預(yù)熱。

3.2.1 將已長(zhǎng)到80%-90%的293T細(xì)胞培養(yǎng)瓶從37℃，5%的CO₂培養(yǎng)箱中取出，先用75%的酒精噴灑于瓶表面，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶旋轉(zhuǎn)放于生物安全柜中，用無菌的移液管吸凈其中的培養(yǎng)基，加5ml的預(yù)熱的PBS洗滌一次，吸凈PBS。

3.2.2 將含EDTA-0.25%tyption用PBS稀釋兩陪到五倍，向該75cm²的細(xì)胞瓶中加入3ml稀釋好的EDTA-0.25%tyption，讓其充分平鋪于細(xì)胞表面。蓋好瓶蓋，將細(xì)胞瓶放在顯微鏡下觀察，直到細(xì)胞變圓，加含10%胎牛血清的DMEM終止反應(yīng)，用移液管輕輕將瓶上的細(xì)胞吹下，將細(xì)胞液移到15ml無菌的離心管中，1000rpm離心3分鐘。

3.2.3 將離心上清吸棄掉，用手指輕輕拍打離心管底將底部細(xì)胞分散開，再加3mlDMEM培養(yǎng)基將分散的細(xì)胞重懸稀釋開，取一定量的細(xì)胞液進(jìn)行n倍稀釋后計(jì)數(shù)，按照細(xì)胞計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行。

3.2.4 計(jì)數(shù)好之后細(xì)胞傳代密度按照2~5×10⁴個(gè)細(xì)胞/cm²進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每個(gè)75cm²的培養(yǎng)瓶中加10mlDMEM培養(yǎng)基，放于37℃，5%的CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3.2.5 24小時(shí)后觀察細(xì)胞狀態(tài)，待細(xì)胞長(zhǎng)到80%-90%時(shí)進(jìn)行下一次傳代培養(yǎng)。