超低IgG胎牛血清Ultra-low IgG FBS·透析胎牛血清Dialyzed FBS·活性炭/葡聚糖處理胎牛血清Charcoal Stripped FBS

一、牛血清質(zhì)量檢定指標(biāo)

1、化學(xué)檢定：包括滲透壓（240～340）、pH（7.0～8.0）、總蛋白含量（3.5～5.0％）、血紅蛋白 （≤0.02％）

2、 微生物檢查：細(xì)菌和真菌——直接培養(yǎng)法、噬菌體——噬斑法和增殖法 支原體——培養(yǎng)法和DNA染色法 、牛病毒——細(xì)胞培養(yǎng)法。要求均為陰性

3、內(nèi)毒素檢測(cè)——凝膠法和動(dòng)態(tài)濁度法 要求內(nèi)毒素含量≤10EU/ml

4、促細(xì)胞生長(zhǎng)測(cè)定（SP2/0-Ag14標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定）

1）zui大增殖濃度≥1.0×106個(gè)/ml、倍增時(shí)間≤20小時(shí)

克隆率＝（陽(yáng)性孔平均數(shù)/培養(yǎng)孔總數(shù)）×100％

2）貼壁效率（ VERO細(xì)胞、二倍體細(xì)胞等）

10％血清――50或100個(gè)細(xì)胞/孔

貼壁效率（％）＝（每孔克隆平均數(shù)/每孔存活的培養(yǎng)細(xì)胞平均數(shù)）×100

相對(duì)貼壁效率＝被測(cè)血清貼壁效率/參考血清貼壁效

以上項(xiàng)目檢定結(jié)果應(yīng)符合2005版《中國(guó)藥典》第三部的相關(guān)規(guī)定。血清廠家應(yīng)在此基礎(chǔ)上結(jié)合疫苗病毒生產(chǎn)工藝建立企業(yè)內(nèi)控檢定項(xiàng)目并建立相應(yīng)的檢定方法，保證疫苗病毒生產(chǎn)的穩(wěn)定性，提高疫苗制品的質(zhì)量。

二、牛血清的分類

根據(jù)牛出生時(shí)間和血清采制分離方法分為：

1、胎牛血清：八月齡胎牛心臟穿刺取血；

2、新生牛血清：出生12～24小時(shí)新生牛靜脈采血；

新生牛血清：采血后靜置自然析出的血清；

標(biāo)準(zhǔn)新生牛血清：經(jīng)離心分離的血清；

普通新生牛血清：融血或微融血的血清；

3、小牛血清：出生三月齡小牛動(dòng)脈采血分離血清；

三、牛血清在細(xì)胞培養(yǎng)基中的主要功能

牛血清是細(xì)胞培養(yǎng)中用量zui大的天然培養(yǎng)基，含有豐富的細(xì)胞生長(zhǎng)必須的營(yíng)養(yǎng)成份，具有極為重要的功能。

1、提供能促使細(xì)胞指數(shù)生長(zhǎng)的激素、基礎(chǔ)培養(yǎng)基中沒(méi)有或含量微小的營(yíng)養(yǎng)物，以及某些低分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；

2、提供結(jié)合蛋白，識(shí)別維生素、脂類、金屬離子，并與有毒金屬和熱源物質(zhì)結(jié)合，起解毒作用；

3、是細(xì)胞貼壁、鋪展生長(zhǎng)所需因子的來(lái)源；

4、起酸堿度緩沖液作用；

5、提供蛋白酶抑制劑，細(xì)胞傳代時(shí)使剩余胰蛋白酶失活，保護(hù)細(xì)胞不受損傷。

四、牛血清的質(zhì)量要求

一）WHO公布的《用動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)生產(chǎn)生物制品規(guī)程》中的要求

1. 牛血清必須來(lái)自有文件證明無(wú)牛海綿狀腦病的牛群或國(guó)家，并應(yīng)具備適當(dāng)?shù)谋O(jiān)測(cè)系統(tǒng)。

2.有些國(guó)家還要求牛血清來(lái)自沒(méi)有用過(guò)反芻動(dòng)物蛋白飼料喂養(yǎng)的牛群。

3.要能證明所用牛血清中不含對(duì)所生產(chǎn)疫苗病毒的抑制物。

4.血清要通過(guò)濾膜過(guò)濾除菌，保證無(wú)菌。

5.無(wú)細(xì)菌、霉菌、支原體和病毒的污染，有些國(guó)家要求無(wú)大腸桿菌噬菌體污染。

6.要求血清對(duì)細(xì)胞有良好的支持繁殖作用。

（二）我國(guó)在對(duì)牛血清的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)zui早在2000年版《中國(guó)生物制品主要原輔材料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)》中提出。包括物理性狀、總蛋白，血紅蛋白、細(xì)菌、真菌、支原體、牛病毒、大腸桿菌噬菌體、細(xì)菌內(nèi)毒素，支持細(xì)胞增殖檢查。2005版藥典頒布之后，小牛血清質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)被納入《中國(guó)藥典》2005年版 第三部 生物制品分冊(cè)。

（三）美國(guó)對(duì)牛血清的質(zhì)量要求：

Gibco 和Hyclone等美國(guó)主要血清供應(yīng)商的牛血清都已進(jìn)入到我國(guó)市場(chǎng)，他們對(duì)血清質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)有嚴(yán)格要求，從血清來(lái)源到產(chǎn)品質(zhì)量都有明確規(guī)定。

1、血清來(lái)源 ：可從世界各地收集胎牛血清，但必須符合其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和美國(guó)農(nóng)業(yè)部進(jìn)口要求。

2、血清的收集：必須符合工業(yè)生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)，低溫采集，一次分離，分離后立即混合凍存。

3、血清的制備：超低IgG胎牛血清、透析血清、γ-射線輻照；

4、除菌過(guò)濾：0.22μm和0.1μm濾膜過(guò)濾；

5、成品分裝：根據(jù)需要分裝成不同規(guī)格。

五、牛血清的使用所產(chǎn)生的常見(jiàn)問(wèn)題

（一）由于血清營(yíng)養(yǎng)豐富，貯存條件特殊，因此在貯存和使用過(guò)程中容易產(chǎn)生以下問(wèn)題：

1、改變培養(yǎng)液的pH值

牛血清的pH理論值為7.0～8.0，培養(yǎng)基在加入規(guī)定量的碳酸氫鈉后（即達(dá)到細(xì)胞生長(zhǎng)所需要的滲透壓），再加入10％的牛血清，一般會(huì)使培養(yǎng)液的pH值發(fā)生改變。因此在使用過(guò)程中應(yīng)注意pH的變化，如有必要可用1mol/L NaOH或1mol/L HCl調(diào)pH到所需值。

2、由于血清的營(yíng)養(yǎng)成分豐富，非常適合細(xì)菌、真菌和支原體等生長(zhǎng)。國(guó)產(chǎn)血清大部分采用手工分裝，因此容易把微生物帶入而使得血清被污染。使用前如果沒(méi)有及時(shí)發(fā)現(xiàn)，將會(huì)把污染物帶入正在培養(yǎng)的細(xì)胞中，而使得細(xì)胞不能正常生長(zhǎng)。

3、血清在貯存解凍過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生沉淀，這是由于血清中含有大量脂蛋白、纖維蛋白及多肽類物質(zhì)，在-15℃冷凍保存解凍后就會(huì)自然形成沉淀，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，沉淀量會(huì)增加。因此在融化血清時(shí)一般應(yīng)先在4℃放置使之解凍，然后放在室溫使血清*融化，以避免沉淀的增加。添加血清時(shí)應(yīng)避免把沉淀加入培養(yǎng)液，否則由于沉淀的存在會(huì)使得所培養(yǎng)的細(xì)胞產(chǎn)生大量黑點(diǎn)，或者細(xì)胞表面將會(huì)覆蓋一層油狀物質(zhì)，影響細(xì)胞的正常生長(zhǎng)。為減少血清的損失，可以把有沉淀的血清收集起來(lái)進(jìn)行離心處理，將上清液加入培養(yǎng)液使用（一般不建議采用過(guò)濾的方法除去沉淀，因?yàn)槌恋頃?huì)堵塞濾膜而無(wú)法過(guò)濾）。

（二）大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)中牛血清對(duì)細(xì)胞及病毒滴度的影響

血清是一種成分復(fù)雜的混合物，不同批次血清對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的促進(jìn)作用不同。大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)中由血清引起的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不佳及病毒滴度的影響表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：

1、細(xì)胞生長(zhǎng)速度緩慢，長(zhǎng)滿單層時(shí)間長(zhǎng)；從同一細(xì)胞瓶中分出兩瓶細(xì)胞，用同一種培養(yǎng)液，分別加入10％的對(duì)照血清和待檢血清，在相同條件下培養(yǎng)72小時(shí)，會(huì)出現(xiàn)對(duì)照血清長(zhǎng)滿單層，而待檢血清大約只有60～70％，這種血清就不適合用來(lái)大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞。

2、細(xì)胞傳代后形態(tài)不正常，細(xì)胞狀態(tài)發(fā)生變化 ；由于血清的質(zhì)量問(wèn)題，使原本狀態(tài)正常的細(xì)胞經(jīng)傳代后形態(tài)會(huì)變差；比如：細(xì)胞瓶里會(huì)出現(xiàn)一些蠕動(dòng)的小黑點(diǎn)（并非污染），或者細(xì)胞表面形成一層油狀覆蓋物；細(xì)胞的輪廓變得模糊，細(xì)胞之間的間隙被血清中的蛋白顆粒填充，從而影響細(xì)胞向四周擴(kuò)展生長(zhǎng)。

3、細(xì)胞傳幾代后就出現(xiàn)脫壁現(xiàn)象，不能連續(xù)傳代 ；質(zhì)量較差的血清缺乏某種細(xì)胞的貼壁因子，會(huì)使細(xì)胞在傳代過(guò)程中逐漸喪失貼壁的能力。細(xì)胞會(huì)從正常的貼壁狀態(tài)，邊緣開(kāi)始萎縮，上翹。觀察到的現(xiàn)象就是細(xì)胞表面不光滑，晃動(dòng)細(xì)胞瓶會(huì)看到細(xì)胞表面有絮狀物隨培養(yǎng)液波動(dòng)。隨著傳代次數(shù)增加，細(xì)胞萎縮的情況越來(lái)越嚴(yán)重，直到zui終*脫壁而死亡。

4、細(xì)胞長(zhǎng)的很好，致密的單層，狀態(tài)也很正常，但是接毒后細(xì)胞基本不發(fā)生病變，做滴度檢測(cè)幾乎測(cè)不出抗原滴度。這種情況也許是因?yàn)檠逯泻信c接種的病毒有同源的特異性抗體。比如血清中經(jīng)常會(huì)存在乙腦抗體，牛腹瀉病毒抗體等，如果存在這些抗體，就會(huì)把接進(jìn)去的病毒給中和掉。如果抗體滴度很高，病毒會(huì)被抗體*中和，就沒(méi)有病毒顆粒在細(xì)胞中增殖，所以會(huì)檢測(cè)不到病毒滴度。這種情況給疫苗企業(yè)造成的損失是相當(dāng)大的，不產(chǎn)毒等于前面所做的那么多工作全部白費(fèi)，浪費(fèi)人力、物力，尤其是時(shí)間上的浪費(fèi)，從培養(yǎng)細(xì)胞開(kāi)始到接病毒，到收液至少需要一兩個(gè)月，一旦出現(xiàn)不產(chǎn)毒的情況，那么這一兩月時(shí)間就白白浪費(fèi)掉了，這也是牛血清給疫苗企業(yè)造成的風(fēng)險(xiǎn)之一。

5、細(xì)胞生長(zhǎng)的狀態(tài)一般，產(chǎn)毒少，毒價(jià)低。這種情況比較常見(jiàn)，細(xì)胞是病毒的載體，由于血清質(zhì)量不好，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不好，病毒就無(wú)法進(jìn)行正常的復(fù)制。并非所有病毒都不能復(fù)制，所以就造成疫苗的效價(jià)不夠，可能造成不合格產(chǎn)品。

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