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HCT-116細(xì)胞,HCT-116細(xì)胞鑒定

發(fā)布時(shí)間:2016-06-01瀏覽:1569次

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封閉

在轉(zhuǎn)膜之后,也就是抗體孵育之前,需要對(duì)膜進(jìn)行封閉。封閉是為了使抗體僅僅只能跟特異的蛋白質(zhì)結(jié)合而不是和膜結(jié)合。常用的封閉液有BSA,脫脂奶粉,血清等,一般用的是脫脂奶粉。脫脂奶粉有些特殊情況是不適用的 ,脫脂奶粉不能與生物素化或伴刀豆蛋白標(biāo)記的抗體一起使用;不能用于磷酸化抗體對(duì)蛋白磷酸化的檢測(cè);不能用于堿性磷酸酶(AP)顯示方法。

抗體孵育——WB真正的難點(diǎn):抗體的使用是一種藝術(shù),一種抗體一個(gè)脾氣。

對(duì)WB結(jié)果有決定性影響的因素是抗體的效價(jià)和如果正確使用手中的抗體。 無論你如何提高自己的轉(zhuǎn)膜技術(shù),和低效之間往往只有數(shù)倍的差異, 而抗體的效價(jià)可以差數(shù)千倍以上;同樣,正確使用抗體可以保證抗體效價(jià) 不被過分的拮抗,謀求特異性和非特異性背景之間差異的zui大化。

一抗:*抗體能和非抗體性抗原特異性結(jié)合的蛋白,包括單克隆抗體和多克隆抗體;二抗:第二抗體能和一抗結(jié)合,即抗體的抗體,其主要作用是檢測(cè)抗體的存在,放大一抗的信號(hào)。一般二抗都會(huì)偶聯(lián)可以檢測(cè)的標(biāo)記(如熒光、放射性、化學(xué)發(fā)光或顯色基團(tuán)),用來檢測(cè)一抗;如果一抗本身偶聯(lián)有這些標(biāo)記,則不需要二抗,就是所謂的直接WB。

那么如何正確的來選擇二抗呢?*根據(jù)一抗的種屬來源選擇二抗;第二根據(jù)一抗的類型選擇二抗,根據(jù)單體數(shù)量和重鏈分類,將抗體分為IgA,IgD,IgE,IgG,IgM五類。其中又可分為幾個(gè)亞型:IgA1-2,IgG1a,2a,2b,3,IgM1-2。

顯色

酶促反應(yīng)可以搭配不同的底物從而實(shí)現(xiàn)不同的顯色方法:化學(xué)發(fā)光Chemiluminescent 和底物顯色Colormetirc/Chromogen,前者靈敏度很高——隨著各大廠家努力開發(fā)研制靈敏度更高的發(fā)光底物,化學(xué)發(fā)光法的靈敏度已經(jīng)達(dá)到pg別,甚至還有 Femto級(jí)別的,靈敏度超過了同位素;而后者由于直接顯色而操作簡便且成本低。zui為大家熟悉當(dāng)數(shù)辣根過氧化物酶HRP(Horseradish Peroxidase,屬于過氧化物酶POD類)和堿性磷酸酶AP(Alkaline Phosphatase),此外還有比較少見的葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase)、β半乳糖苷酶 β-Galactosidase 。

常見問題分析:

1.曝光后背景過高且不均勻

封閉不充分:延長封閉時(shí)間,更換合適的封閉劑;一抗?jié)舛冗^高:增加一抗稀釋倍數(shù);抗體孵育溫度過高:4℃孵育;二抗非特異性結(jié)合或與封閉劑交叉反應(yīng):設(shè)置二抗對(duì)照(不加一抗),降低二抗?jié)舛取?/span>

洗膜不充分:增加洗膜次數(shù)

2.沒有陽性條帶或很弱

一抗、二抗不匹配:訂購試劑時(shí)認(rèn)真選取一抗與組織種屬,一抗與二抗或底物與酶系統(tǒng)之間相匹配的抗體及底物,可通過設(shè)置內(nèi)參驗(yàn)證二級(jí)系統(tǒng)的有效性; 更換更好的抗體;一抗,二抗?jié)舛鹊停涸黾涌贵w濃度,延長孵育時(shí)間封閉劑與一抗有交叉反應(yīng):封閉時(shí)使用溫和的去污劑,更換封閉劑樣本中無靶蛋白或靶蛋白含量過少,設(shè)置陽性對(duì)照,如果陽性對(duì)照有結(jié)果,但標(biāo)本沒有則可能是標(biāo)本中不含靶蛋白或是靶蛋白含量太低,后者可增加樣本上樣量;轉(zhuǎn)膜不充分還洗膜過度:使用麗春紅S檢測(cè)轉(zhuǎn)膜效果,PVDF膜需浸透,正確的轉(zhuǎn)膜操作,勿過度洗膜;曝光時(shí)間過短:延長曝光時(shí)間,更換更靈敏的發(fā)光液

3.背景有白色/黑色斑

轉(zhuǎn)膜時(shí)有氣泡或抗體分布不均:盡量除去氣泡,抗體孵育時(shí)保持搖動(dòng);封閉劑溶解不充分有顆粒狀

HCT-116細(xì)胞,HCT-116細(xì)胞鑒定凍存:

1.將細(xì)胞消化下來,移入離心管離心,棄上清

2.準(zhǔn)備凍存液比例:50%FBS+40%培養(yǎng)基+10%DMSO(現(xiàn)用現(xiàn)配)

3.加1.5凍存液在離心管中,將細(xì)胞吹打均勻,移入凍存管內(nèi).

放入-20度冰箱2-4小時(shí)后.再放入-80度冰箱過ye,第二天放入液氮罐保存.

HCT-116細(xì)胞,HCT-116細(xì)胞鑒定常見的污染如下:

1、細(xì)菌:細(xì)菌在普通倒置顯微鏡下為黑色細(xì)沙狀,根據(jù)感染細(xì)菌的不同,可有不同的外形,培養(yǎng)液一般會(huì)渾濁變黃,對(duì)細(xì)胞生長影響明顯。

2、霉菌:培養(yǎng)液是清亮的,倒置顯微鏡下無雜質(zhì),37度孵箱培養(yǎng)2-3天,仍清亮,但出現(xiàn)絮狀雜質(zhì),鏡下可見呈細(xì)絲狀的團(tuán)狀漂浮物,可看到明顯的菌絲,細(xì)胞仍可生長,但時(shí)間長之后,細(xì)胞的活力狀態(tài)變差,

用硫酸銅溶液擦拭CO2孵箱內(nèi),再把水盤里也加上飽和量的硫酸銅?;蛘咴谂囵B(yǎng)箱的托盤加入飽和的消毒磷酸氫二鈉高鹽液體,可以防止霉菌污染。

3、支原體:黑色的,好象多為多形,培養(yǎng)液一般培養(yǎng)液一般會(huì)渾濁,原體感染,國內(nèi)血清很多都沒有做支原體陰性檢測(cè),而支原體是牛血清中zui常見的微生物之一。而且它不能用過濾的辦法除去。支原體感染細(xì)胞以后,細(xì)胞病變不很明顯,只是慢慢凋亡。

4、黑蛟蟲:可以穿透濾膜,也可以通過空氣傳播,低倍下為黑色點(diǎn)狀,高倍下可看見黑色的小蟲游來游去,培養(yǎng)液也是不渾的,一般不會(huì)太影響,細(xì)胞還是可以用的。

5、真菌:一般培養(yǎng)液清亮,不變色,鏡下有絲狀物,有些真菌開始很像死細(xì)胞碎片,只是它很多很多的小塊很清楚,象珊瑚狀,不象細(xì)胞碎片分不清,慢慢的會(huì)長出很細(xì)的黑色絲狀物。真菌生長的比較慢,不象細(xì)菌那么容易被發(fā)現(xiàn),但是一旦發(fā)現(xiàn)有它的存在細(xì)胞就被污染了,也很難救活了。

6、原蟲:培養(yǎng)液可輕微渾濁,顯微鏡下那些細(xì)小的點(diǎn)狀物數(shù)量非常多,輕微活動(dòng),細(xì)胞雖然可以生長但繁殖速度卻明顯減慢,而且細(xì)胞狀態(tài)不好,邊緣不清楚,細(xì)胞不透亮。他們與細(xì)胞可共生但會(huì)與細(xì)胞爭奪營養(yǎng)。這種共生是非常普遍的,但他們的數(shù)量小,細(xì)胞站優(yōu)勢(shì)所以不會(huì)影響到細(xì)胞的正常生長,只有當(dāng)他們到達(dá)一定的數(shù)量時(shí)就會(huì)影響到細(xì)胞的生長,zui終形成惡性循環(huán)。

HCT-116細(xì)胞,HCT-116細(xì)胞鑒定運(yùn)輸:凍存的細(xì)胞干冰運(yùn)輸,復(fù)蘇的細(xì)胞冰袋運(yùn)輸。冬季我們會(huì)選擇全血清包被細(xì)胞株運(yùn)輸,運(yùn)輸途中細(xì)胞處于休眠狀態(tài),避免天氣過冷導(dǎo)致的細(xì)胞死亡。

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