CAL-27細胞

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常規(guī)細胞培養(yǎng)方法

初代培養(yǎng)

原理

將動物機體的各種組織從機體中取出，經(jīng)各種酶（常用胰蛋白酶）、螯合劑（常用EDTA）或機械方法處理，分散成單細胞，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細胞得以生存、生長和繁殖，這一過程稱原代培養(yǎng)。    

儀器、材料及試劑

儀器：培養(yǎng)箱（調(diào)整至37℃），培養(yǎng)瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、紗布、手術器械、血球計數(shù)板、離心機、水浴箱（37℃）

材料：動物組織塊

試劑：1640培養(yǎng)基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒

初代消化培養(yǎng)法

1.準備：取各種已消毒的培養(yǎng)用品置于凈化臺面，紫外線消毒20分鐘。開始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。

2.布局：點燃酒精燈，安裝吸管帽。

3.處理組織：把組織塊置于燒杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如懷疑組織可能污染，可先置于含有青鏈霉素的混合液中30~60分鐘。

4.剪切：用眼科剪把組織切成2~3毫米大小的塊，以便于消化。加入比組織塊總量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角燒瓶中，結扎瓶口或塞以膠塞。

5.消化：或用恒溫水浴，或置于37℃溫箱消化均可，消化中每隔20分鐘應搖動一次，如用電磁恒溫攪拌器消化更好。消化時間依組織塊的大小和組織的硬度而定。

6.分離：在消化過程中見消化液發(fā)混濁時，可用吸管吸出少許消化液在鏡下觀察，如組織已分散成細胞團或單個細胞，立即終止消化，隨即通過適宜不銹鋼篩，濾掉尚未充分消化開的組織塊。低速（500~1000轉/分）離心消化液5分鐘，吸出上清，加入適量含有血清的培養(yǎng)液。

7.計數(shù)：用計數(shù)板計數(shù)，如細胞懸液細胞密度過大，再補加培養(yǎng)液調(diào)整后，分裝入培養(yǎng)瓶中。對大多數(shù)細胞來說，pH要求在7.2~7.4范圍，培養(yǎng)液呈微紅色，如顏色偏黃，說明液體變酸，可用NaHCO3調(diào)整。

8.培養(yǎng)：置于36.5℃溫箱培養(yǎng)，如用CO2溫箱培養(yǎng)，瓶口需用紗布棉塞或螺旋帽堵塞，紗布塞易生霉菌，每次換液時需要換新塞。

我們實驗室細胞傳代的一般方法

這一方法較簡單，不需要離心，而且消化后細胞很少聚集成團，具體步驟如下：

1、吸盡待傳代細胞瓶內(nèi)的培養(yǎng)液，按1：1 的比例加入適量0.25％胰酶和0.0 2％EDTA（一般100ml培養(yǎng)瓶各加2滴管消化（消化時不要晃動培養(yǎng)瓶，以免消化不*而導致細胞成片脫落，從而導致細胞成團，無法吹散）。

2、消化致細胞變圓，細胞相互脫離接觸但還未從瓶壁脫落時，吸盡胰酶和EDTA。

3、利用殘留的胰酶和EDTA繼續(xù)消化數(shù)分鐘。

4、加入適量培養(yǎng)液，反復吹打，然后分別接種致新的培養(yǎng)瓶。

注：消化的時間需根據(jù)不同細胞摸索確定。

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BHK-21 [C-13]倉鼠腎成纖維細胞

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